Biotechnologia.pl
łączymy wszystkie strony biobiznesu
Śmiertelna tetrodotoksyna po raz pierwszy wykryta u zwierząt lądowych
Tetrodotoksyna (TTX) znana jest jako jedna z najniebezpieczniejszych trucizn na świecie. Mechanizm jej działania polega na blokadzie kanałów sodowych w neuronach. Obecność TTX spostrzeżono już u zwierząt żyjących w wodzie (głównie morskiej), nigdy wcześniej jednak nie wykryto tego związku u bezkręgowców żyjących wyłącznie na lądzie. Wiadomość ta jest niejako nowością, gdyż to pierwsze tego rodzaju udokumentowane badanie. Tetrodotoksyna jest o tyle interesująca, gdyż pochodzenie oraz szlak metaboliczny prowadzący do jej syntezy nie są znane, a potencjał wykorzystania w nauce czy przemyśle – godny uwagi.

Występowanie tetrodotoksyny stwierdzono u pewnych gatunków rozgwiazd, krabów, ryb morskich (w tym rozdymkowatych), ośmiornic, traszek i salamander. Z drugiej strony, właśnie Bipalium adventitium i Bipalium kewense to lądowi przedstawiciele gromady płazińców, u których potwierdzono obecność niezmiernie szkodliwej substancji. Przypuszcza się, że zwierzęta te wykorzystują ów śmiercionośny środek w celu ujarzmienia ofiary wielokrotnie przewyższającej je rozmiarami. Niemniej jednak istnieje możliwość, że służy on za narzędzie obrony przed drapieżnikami atakującymi Bipalium. Wyniki eksperymentów przeprowadzonych przez dr Amber Stokes i współpracowników z California State University sugerują więc potencjalny szlak bioakumulacji TTX w środowisku lądowym.

Pod względem chemicznym tetrodotoksyna (C11H17N3O8) jest wielofunkcyjnym, heterocyklicznym związkiem organicznym zawierającym wiele grup hydroksylowych. Występuje również pod innymi nazwami, takimi jak anhydrotetrodotoksyna czy kwas tetrodonowy. Ma charakter niskocząsteczkowy i niebiałkowy.

Do objawów zatrucia tetrodotoksyną zalicza się ślinotok, mrowienie w jamie ustnej, osłabienie mięśni, brak koordynacji ruchowej, drętwienie skóry, biegunkę, drgawki, a w najcięższych przypadkach paraliż i śmierć w wyniku uduszenia. Nasuwa się pytanie – jakie jest podłoże molekularne takich symptomów ?

Otóż TTX „zatyka” kanały sodowe bramkowane napięciem w silny i wysoce selektywny sposób, pozostając bez żadnego wpływu na inne kanały jonowe oraz receptory. Wiąże się z tym kanałem wyłącznie od strony zewnętrznej błony neuronu. Toksyna zasłania filtr selektywności i przez to uniemożliwia przepływ jonów sodu przez białkową strukturę poru. Punktem docelowym tetrodotoksyny są dwa specyficzne motywy aminokwasowe będące częścią pętli P, łączącej ze sobą helisy 5 i 6 segmentów. Struktury te wchodzą w skład czterech domen homologicznych podjednostki α kanału VGSC (voltage - gated sodium channel). Swoiste rozpoznanie i wiązanie zabójczej substancji do tych elementów kanału skutkuje inhibicją rozprzestrzeniania się potencjałów czynnościowych, a przez to porażeniem funkcji mięśni i nerwów.

Obecność tetrodotoksyny u dwóch gatunków lądowych bezkręgowców wykazano, posługując się testem CIEIA (Competitive Inhibition Enzymatic Immunoassay). Jest to test immunologiczny wykorzystujący dostępne komercyjnie przeciwciało monoklonalne skierowane specyficznie na TTX. Za jego pomocą można było zidentyfikować oraz dokonać pomiaru ilościowego badanej substancji. Do niewątpliwych zalet tej metody zalicza się użycie łatwo dostępnych odczynników i niedrogiej aparatury laboratoryjnej, a także większą czułość na TTX w odniesieniu do HPLC.

W zmodyfikowanym teście CIEIA, BSA „mocuje” wyekstrahowaną w przygotowanych próbkach tetrodotoksynę do mikropłytki. Następnie toksynę rozpoznaje swoiście przeciwciało pierwszorzędowe. To zaś jest rozpoznawane przez drugorzędowe sprzężone z alkaliczną fosfatazą. Po dodaniu do tak powstałego układu substratu dla enzymu – pNPP, zachodzi reakcja hydrolizy generująca produkty w postaci p-nitrofenolu i fosforanu. Ilość żółto zabarwionego pNP w silnie alkalicznym środowisku oznacza się kolorymetrycznie, co pozwala na ilościową analizę badanego związku.

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) jawi się jako skuteczna metoda ilościowego pomiaru TTX, jednak jest czasochłonna oraz wymaga większego nakładu pieniężnego. Ponadto obliguje do przejścia specjalistycznego przeszkolenia z zakresu obsługi sprzętu. Jednakże, w przeciwieństwie do wyżej wspomnianego testu immunologicznego, w metodzie HPLC można zidentyfikować analogi tetrodotoksyny. W celu weryfikacji tożsamości związku chemicznego, porównano do siebie diagramy HPLC standardu TTX do tych uzyskanych z prób. To potwierdziło autentyczność badanej struktury.

W świetle licznych doniesień o śmiertelnych zatruciach wspominaną toksyną (np. po spożyciu dania ze znanej w kuchni japońskiej ryby fugu), perspektywa jej zastosowania w medycynie wydaje się być nieprawdopodobna. Jednakże to właśnie ona posłużyła do głębszego zbadania kanałów VGSC. Wyniki tych eksperymentów pozwoliły na klasyfikację tych kanałów pod względem ich wrażliwości na działanie tetrodotoksyny. Oprócz funkcjonalnego scharakteryzowania kanałów VGSC, użycie tetrodotoksyny poszerzyło zakres wiedzy o mechanizmie transdukcji sensorycznej. W tym przypadku TTX posłużyła jako narzędzie do wyjaśnienia działania chemoreceptorów wrażliwych na ciśnienie parcjalne tlenu.

Działanie tetrodotoksyny koncentruje się na systemie nerwowym, toteż potencjał tej osobliwej cząsteczki leży w… projektowaniu środków przeciwbólowych. Na to wskazują rezultaty doświadczeń, w których zwierzętom podawano TTX w dawkach niższych od tych zdolnych do zakłócania wytwarzania i przewodzenia potencjału czynnościowego. Również działanie przeciwzapalne tetrodotoksyny wskutek hamowania funkcji niektórych komórek układu odpornościowego wydaje się mieć obiecujące przeznaczenie w przyszłości.

Źródła

Stokes A. N., Ducey P.K., Neuman-Lee L., Hanifin C.T., French S.S. i inni (2014) Confirmation and Distribution of Tetrodotoxin for the First Time in Terrestrial Invertebrates: Two Terrestrial Flatworm Species (Bipalium adventitium and Bipalium kewense). PLoS ONE 9(6): e100718. doi:10.1371/journal.pone.0100718

Stokes A. N., Williams B. L., French S. S. (2012) An improved competitive inhibition enzymatic immunoassay method for tetrodotoxin quantification. Biological Procedures Online, 14:3

Nieto F. R., Cobos E. J. i inni (2012) Tetrodotoxin (TTX) as a therapeutic agent for pain. Mar Drugs 10(2):281-305.

KOMENTARZE
Newsletter